RNAi, a cura para todos os males ou apenas mais um “flop” científico?!?

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Contrariamente ao que se possa pensar, não se trata da última invenção da Apple: RNAi, ou RNA de interferência, é uma das descobertas mais empolgantes do séc. XX, que revolucionou a forma como hoje se faz investigação e que valeu a Andrew Fire (Stanford University School of Medicine, Stanford, USA) e a Craig Mello (University of Massachusetts Medical School, Worcester, USA) o Prémio Nobel da Fisiologia ou da Medicina em 2006, uns meros oito anos após a descoberta inicial.

O admirável mundo novo…
Quando o presidente Nixon declarou “guerra ao cancro” na década de 60, altura em que a quimioterapia parecia oferecer tanta esperança aos milhares de doentes afectados por esta doença, estaria ele (e todos os cientistas que diariamente se empenham numa luta, de alguma forma, desigual) com certeza longe de imaginar que 50 anos mais tarde estaríamos ainda praticamente no mesmo ponto de partida… Na realidade, o cancro é um problema altamente complexo, que requere conhecimento e compreensão profundos de como as nossas células funcionam. Em boa verdade, não é só o cancro que continua a apresentar grandes desafios aos cientistas, mas também outras doenças, como a Hepatite C, a SIDA, doenças auto-imunológicas e neuro-degenerativas. O trabalho não escasseia, mas… e a esperança nesse admirável mundo novo?!

Para pôr o problema em perspectiva, relembro 1 como são constituídos os nossos corpos e como esta magnífica máquina funciona. O nosso corpo, qual personagem feito com peças Lego®, é composto por biliões de células. Digamos que as células são os tijolos com que todos os seres vivos são construídos. E, tal como numa casa ou num brinquedo Lego®, cada peça tem que se ligar a outra de uma forma particular para que o todo seja, afinal, coerente. Assim, as células agrupam-se em tecidos (por exemplo, o tecido ósseo), vários tipos de tecidos organizam-se em órgãos e os órgãos em sistemas (circulatório, respiratório, digestivo, etc). Vários sistemas agrupam-se, finalmente, naquilo a que chamamos um “corpo”. Ora, este “corpo” tem um trabalho muitíssimo difícil… É ele que nos leva a todo o lado, sofre as mazelas que lhe impomos (consciente e inconscientemente), processa os alimentos para poder assim alimentar as células, e combate os vírus, bactérias e afins que nos atacam diariamente… Processa as imagens e mensagens que constantemente recebemos em pensamentos (regra geral) lógicos e coerentes, permitindo-nos assim viver. Claro que isto é uma enorme simplificação das tribulações pelas quais os nossos corpos passam diariamente, uma visão verdadeiramente naïve, mas uma visão que serve o propósito de hoje: o passar a mensagem de que os nossos corpos são verdadeiros heróis na luta pela sobrevivência e que ocupam as suas vidas a certificarem-se de que nós podemos viver a nossa. Fabuloso!


A sofisticação da “máquina” e as exigências do nosso dia-a-dia têm um preço elevado

Claro que para manter o nosso corpo em boa forma e em funcionamento pleno, a Natureza desenvolveu programas de manutenção bastante rigorosos e extensos. A verdade é que há, por exemplo, um vastíssimo programa diário de regeneração. Todos os dias, os nossos corpos testemunham o nascimento (por via de divisão celular, durante a qual a célula mãe dá origem a duas células filhas2) de biliões de células, sem que os nossos corpos “cresçam” desproporcionalmente. Tal significa que, em cada nascimento celular, o equilíbrio é reencontrado através da morte (apoptose) de um número equivalente de células3. Mas, nem todas as células podem ser renovadas, e o caso típico é o das células nervosas.

Para além deste número perfeitamente brutal de células que se dividem e que morrem – processos aparentemente simples mas extraordinariamente complexos do ponto de vista molecular – as nossas células lutam permanentemente com “agressões físicas”. Não me refiro só à poluição, ou aos “químicos” que ingerimos e inalamos, mas também ao oxigénio que respiramos e sem o qual não sobreviveríamos, e ao Sol, essa grande estrela que nos aquece e que ilumina o nosso planeta. As nossas células mantêm dentro de si um ambiente “redutor”, algo que é permitido através do trabalho de umas enzimas (proteínas) que se certificam que os radicais livres, peróxidos e outras espécies químicas reactivas capazes de danificar o nosso DNA, RNA e/ou proteínas são “neutralizados”. Para fazer frente às toxinas com que nos deparamos no dia-a-dia, as nossas células utilizam as enzimas de desintoxicação que transformam substâncias nocivas em substâncias inertes ou menos nocivas. Não será de espantar, portanto, que o stress oxidativo esteja envolvido em muitas doenças, tais como a doença de Alzheimer e a arteriosclerose. No entanto, os nossos corpos têm de ser discernentes e permitir que, em determinadas situações tais como durante algumas infecções, haja stress oxidativo… dentro de certa medida, claro! O mesmo se passa com as radiações de raios ultravioleta que recebemos do Sol: precisamos delas para a produção de, por exemplo, vitamina D, mas demasiada exposição ao sol pode levar a queimaduras e a danificar o nosso DNA. Isto causa, sem dúvida, stress celular e leva à activação de uma série de enzimas reparadoras do DNA. Em casos mais extremos, em que as células não conseguem lidar com os “estragos”, os nossos corpos podem mesmo vir a sofrer de melanomas, ou cancros da pele.

A mensagem principal é, portanto, que tudo em certa medida e com moderação permite às nossas células lidar com os problemas que lhes vão surgindo, por assim dizer, permitindo uma vivência saudável dos nossos corpos. A verdade é que isto é mais simples de dizer, do que de fazer… E, assim, não há na história da humanidade nenhum ser humano que não tenha estado doente pelo menos uma vez na vida… Na maior parte dos casos, para a maioria das patologias que nos afligem vulgarmente, há tratamentos disponíveis e a cura é possível, mas noutros casos mais extremos e que já aqui referi, tal não é tão trivial. É nestas situações mais delicadas que nós esperamos poder vir a utilizar, num período relativamente breve (note-se a cautela), a técnica hoje conhecida como RNAi.


O que é o RNAi?

Dentro das nossas células, a informação que é requerida para a nossa sobrevivência encontra-se codificada no DNA, o famoso ácido desoxirribonucleico. No entanto, para que essa informação possa ser utilizada pelas nossas células, ela tem que ser traduzida para um “idioma diferente”: o idioma do RNA, ou ácido ribonucleico. O RNA também ele tem que ser traduzido para outro idioma: o das proteínas. Elas são os soldados celulares, as entidades moleculares, responsáveis por levar a cabo as diferentes funções celulares 1. Assim sendo, não é de admirar que a falta, ou a presença inoportuna, de uma ou várias proteínas seja responsável e/ou esteja implicada em variadíssimas doenças. Nos casos em que se verifica a presença indesejada de uma proteína, uma solução “simples” é a eliminação (ou a redução dos níveis) dessa proteína. É isso que o RNAi nos permite fazer, de uma forma extraordinariamente elegante e, mais importante ainda, específica.

O RNA de interferência (RNAi) é, basicamente, um mecanismo que nos permite inibir a ‘tradução” dos genes em proteínas. Apesar de o fenómeno só ter sido reconhecido em 1998 por Fire e Mello4, historicamente, já existiam várias descrições de silenciamento de genes, numa variedade de organismos (maioritariamente em plantas, moscas e vermes). Tratavam-se de processos aos quais foram sendo dados nomes diferentes e que se pensava serem, de facto, diferentes, mas assim que os cientistas começaram a compreender um bocadinho melhor aquilo que se passava, aperceberam-se de que se tratava, afinal, da mesma coisa. Um dos primeiros casos que intrigou bastante os cientistas passou-se com flores: tentava-se modificar a cor de umas petúnias rosa ou violeta para tons mais escuros. Quando os cientistas efectuaram as experiências, o resultado foi o oposto: obtiveram flores parcialmente, ou até mesmo totalmente, brancas… A cor, ou melhor, a proteína responsável pela cor) tinha sido inibida e não “amplificada” como se pretendia inicialmente!

Nas células de mamíferos, podemos dizer de uma forma simplificada que a dupla hélice de DNA se transforma numa só cadeia de RNA mensageiro (mRNA) que, por sua vez, se transforma numa só cadeia polipeptídica (o colar feito de aminoácidos, os tijolinhos das proteínas). Na realidade, nas nossas células, só se encontra RNA de dupla cadeia (double-strand RNA, ou dsRNA) quando as células foram infectadas por um vírus. Por outras palavras, dsRNA é um intermédio molecular de uma infecção viral. E assim que a célula é “pirateada” por um vírus, as nossas células activam as suas defesas antivirais com a produção dos formidáveis Interferons1. Isto leva à inibição generalizada e indiscriminada (e não especifica) da síntese proteica e, eventualmente, à morte da célula infectada. Porque é que isto é importante? Porque era graças ao sistema dos Interferons que não era possível observar RNAi em células de mamíferos e por isso permaneceu, durante uns anos, uma curiosidade, sem dúvida fascinante, mas limitada ao mundo das plantas e afins… Em 2001, tudo mudou!

RNAi, a tesoura molecular capaz de ‘cortar’ mRNA
Nas plantas, na mosca Drosophila melanogaster e no verme Caenorhabditis elegans é possível utilizar moléculas de dsRNA com mais de 200 nucleótidos (as pérolas do colar) de comprimento. Tal é impossível nas células de mamíferos porque, como já referi supra, as nossas células identificam essas longas moléculas como sendo um intermediário da replicação viral, levando-as, desse modo, a activar as defesas antivirais e impedindo a observação de RNAi nas células de mamíferos. Assim foi que, em 2001, um artigo publicado pelo grupo liderado por Tuschl5 foi recebido por parte da comunidade cientifica com uma enorme satisfação. Finalmente, era possível utilizar RNAi em células humanas, desde que fossem utilizadas moléculas de siRNA curtas, compostas por 21-23 nucleótidos! Mais uma parte do mecanismo de RNAi tinha sido identificado. O sonho de utilizar o RNAi na clínica e em doentes era cada vez mais uma possibilidade real!

Mas, como funciona a tal tesoura?!? Imagine-se uma placa de Petri com células em cultura, prática rotineira de “cultura de células e tecidos”. Para a reduzir os níveis da proteína X por meio do RNAi, basta “desenhar” uma sequência de RNA complementar ao mRNA da proteína em questão (lembre-se: DNA  mRNA  proteína). Essa sequência é particular a esse mRNA, o que significa que quando a cadeia de RNA for sintetizada, juntamente com a sua cadeia complementar (para formar o RNA de dupla cadeia, dsRNA), essa cadeia vai ser compatível com um único mRNA e vai, portanto, alvejar uma única proteína. Em organismos sem o sistema do Interferon, o RNAi pode ser conseguido com a introdução de longas cadeias de dsRNA, que são depois cortadas em segmentos mais curtos de 21-23 nucleótidos, os chamados short-interfering RNA (siRNA). Os siRNA são, em boa verdade, dsRNA capazes de induzir RNAi. Ou seja, dsRNA e siRNA são moléculas, RNAi é o processo. Regressemos à nossa placa de Petri: envolvemos o dsRNA num lipossoma (um balão feito de lípidos) para que assim possa atravessar a membrana celular, também ela feita de lípidos, e esperamos pacientemente (usualmente dois dias) para que esse siRNA active uma série de proteínas que o vão “guiar” até à molécula de mRNA que está a ser alvejada (X), e para que sejam subsequentemente activadas as tesouras que efectuarão o corte desse mesmo RNA mensageiro (mRNA). Uma vez que o mRNA X é destruído, deixa de existir o mensageiro que indica a necessidade de produzir a proteína X.

É necessário salientar que o siRNA vai apenas alvejar as moléculas de mRNA e, portanto, a síntese proteica, mas não vai cortar as moléculas de proteína X que já tinham sido previamente sintetizadas, ou produzidas, na célula. Quer isto dizer que o RNAi resulta, na maior parte dos casos, na redução dos níveis da proteína X e não na sua eliminação total, particularmente se essa proteína tiver um tempo de vida médio elevado. Isto não preclude necessáriamente o sucesso do RNAi, quer a nível clínico, quer a nível de investigação.


Temos, então, uma bala mágica?!?

Com optimismo cauteloso, atrevo-me a dizer que sim. O que não me atrevo é a fazer previsões cronológicas… Pessoalmente, todos os dias, quer na bancada, quer à secretária, apercebo-me de como são pequenos e pueris os passos dados na investigação. É um processo lento e, por vezes, penoso. A imagem que muitas vezes se deixa transparecer, e que é de alguma maneira alimentada pela imprensa, é de grande euforia por parte da comunidade científica. A verdade é que se, por um lado, os cientistas são uns optimistas, por outro, a morosidade que a investigação biomédica envolve (contrariamente a outros ramos, como a engenharia, por exemplo), faz com que nos vejamos obrigados a convencer aqueles que financiam os nossos projectos, de que vale mesmo a pena continuar a financiá-los, porque – vale dizer – “estamos quase lá”…

Mas, estamos, ou não estamos, quase lá? Como com todas as terapias, os maiores problemas são a produção, a administração e a toxicidade. Para que a indústria farmacêutica “embarque” na produção de um medicamento, é necessário que a produção seja possível a um preço razoável e que seja possível manufacturar quantidades apropriadas. O medicamento tem de ser estável (tanto na prateleira, como no organismo, até chegar ao seu alvo) e fácil de administrar (é mais fácil tomar um comprimido do que ter que injectar uma substância). O medicamento tem de ser seguro, isto é, não tóxico para o doente (ou pelo menos tem de ter um nível de toxicidade “aceitável”) e tem de ser eficiente. Tem também de ser selectivo, actuando nos alvos certos, na altura certa. O medicamento tem, portanto, que provocar melhoras visíveis e significativas. Não nos vale de nada ter um agente eficaz na placa de Petri que não seja capaz de satisfazer estas condições. E, neste cenário complexo, onde se situa o RNAi?

A produção não é vista como um problema de maior. Mas a administração e a estabilidade das moléculas de siRNA são. Depois do siRNA entrar nas nossas células, essas moléculas vão ter de “encontrar” os seus alvos e “disparar” antes que sejam elas próprias destruídas ou que a sua potência seja reduzida. Valha-nos a certeza de que o mecanismo de RNAi é altamente potente e de que apenas umas poucas moléculas de siRNA são suficientes para causar uma redução significativa dos seus alvos. O que não sabemos – e isto pode vir a ser um problema significante – é se as concentrações terapêuticas serão tóxicas para os doentes. Há cada vez mais companhias interessadas em desenvolver terapias de RNAi, e para tal estão a desenvolver diferentes moléculas de dsRNA, capazes de induzir RNAi e, assim, silenciar determinados genes (por exemplo, os malfadados oncogenes, genes capazes de, sob determinadas circunstâncias, transformar uma célula normal numa célula tumoral). Na maior parte dos casos, estão a modificar as moléculas de dsRNA a nível químico para que estas sejam mais estáveis e ainda mais específicas (porque, apesar de a inibição através de RNAi ser muito específica, são ainda observadas respostas paralelas, não específicas). Na realidade, desde os relatórios iniciais que identificaram o siRNA e dsRNA como intermediários de RNAi, foram já descritas outras variedades tais como microRNAs (miRNA) e piwiRNAs (piRNA). À medida que o nosso conhecimento dos mecanismos moleculares de RNAi aumenta, aumentam também as nossas possibilidades de utilizar esse conhecimento para o tratamento de um número variado de doenças.

Bala mágica, ou não, a verdade é que RNAi foi votada a “Descoberta do Ano” em 2002 pela revista Science. Nessa altura poucos laboratórios se podiam dar ao luxo de utilizar RNAi: era caro e nem sempre funcionava. A habilidade de desenhar (prever) quais as sequências que são mais eficientes a reduzir os alvos aumentou exponencialmente e, hoje em dia, já se encontram siRNA para todas as moléculas do genoma nas prateleiras. Hoje, uma grande percentagem de laboratórios estão a usar RNAi rotineiramente nas suas investigações proteómicas. Ou seja, inibe-se (reduzem-se) os níveis da proteína X, e observa-se o que acontece às respostas em estudo. E tecnicamente isto é hoje tão simples que os cientistas podem dar-se ao luxo de “ir à pesca” em bibliotecas de siRNA e descobrir novos componentes daquilo que estudam… É mesmo um admirável mundo novo! Não duvide: o actual conhecimento daquilo que se passa dentro das células, das interacções entre as variadíssimas proteínas (pelo menos 30 000) está a aumentar exponencialmente com o uso do RNAi. E, com esse conhecimento, também aumentou o nosso entusiasmo e esperança quanto ao que o futuro nos pode trazer!


Ana Paula Costa Pereira

Licenciada e Doutorada em Bioquímica na University College Cork (Cork, Irlanda), docente e investigadora no Imperial College London, em Londres, no Reino Unido

Referências
1 Costa Pereira AP. (2002). Transdução de Sinais: pura tagarelice cellular? Biosofia, 16: 34-38.
2 Pardo M. (2004). Mitose: a maravilha da miniaturização. Biosofia, 21: 30-33
3 Costa-Pereira AP. (2001). Mitose e apoptose: uma questão de vida ou de morte! Biosofia, 8: 37-40
4 Fire A, Xu S, Montgomery M, Kostas S, Driver S. e Mello C. (1998). Potent and speciic genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391: 806-811.
5 Elbashir SM, Harborth J, Lendeckel W, Yalcin A, Weber K e Tuschl T. (2001). Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 411: 494-498.

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